冷冻保存的睾丸组织可以在体外培养以产生精子，用于青春期前男孩癌症患者和成年不育男性患者的生育力恢复。目前睾丸组织的低温保存方法仍不理想，冷冻保存的睾丸组织可能发生纤维化或者无法完成精子发生。睾丸类器官作为一种新型研究工具，在保持和恢复男性不育方面显示出巨大的潜力。但是，针对睾丸类器官的低温保存研究更是稀缺，不当的冻存方法可能导致类器官特性的丧失，无法满足实际需求。2021级博士生谭佳（导师：周新丽教授）对小鼠睾丸组织和类器官的体外培养和低温保存进行了系统研究。
（1）高效体外睾丸组织培养策略的探索与应用
体外睾丸组织培养是研究精子发生和治疗男性不育症的重要方法。通过将不同光交联水凝胶运用到睾丸组织的体外培养，包括GelMA、AlgMA、DexMA，以优化睾丸组织的体外培养系统。AlgMA水凝胶培养的睾丸组织在第32天展现出最高的生精小管完整性率、精母细胞密度和SOX9阳性生精小管比例，而DexMA水凝胶则在培养后期促进了较高的睾酮产生。相关研究成果发表在化学领域传统TOP期刊INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES（Tan J, Li JH, Zhang YQ, Li X, Han S, Li Z, et al. Application of photocrosslinked gelatin, alginate and dextran hydrogels in the in vitro culture of testicular tissue. Int J Biol Macromol. 2024;260. 中科院一区top，JCR：Q1）。
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图1 水凝胶含水量对睾丸组织周围氧浓度分布有影响的机制示意图
（2）水凝胶包封有助于使用低浓度保护剂保存小鼠睾丸组织
冷冻保存的睾丸组织为恢复男性不育症患者的生育能力提供了一种有前途的方法。通过对比不同类型、浓度和厚度的水凝胶对小鼠睾丸组织冷冻保存的影响，以优化水凝胶包封参数，并评估了水凝胶作为潜在的低温保护剂的可能性与作用。使用3%海藻酸盐或5%GelMA水凝胶薄层包封，配合降低的保护剂浓度，可以有效地保存小鼠睾丸组织，减少毒性损伤，并保持组织形态和功能。冷冻显微镜和差示扫描量热法进一步证实了水凝胶抑制冰晶生长的能力。相关研究成果发表在生物材料领域传统TOP期刊Colloids and Surfaces B（Tan J, Jia SQ, Xu Q, Lin CY, Cao YK, Shen J, et al. Hydrogel encapsulation facilitates a low-concentration cryoprotectant for cryopreservation of mouse testicular tissue. Colloid Surface B. 2024;242. 中科院二区top，JCR：Q1）。
图2 水凝胶对包封睾丸组织快速冷冻的保护机制
（3）优化睾丸类器官的生成与冷冻保存策略
睾丸类器官对于维持男性生育能力甚至恢复男性不育具有重大潜力。通过探索小鼠年龄和细胞数量对睾丸细胞自聚成球的影响，并测试不同的培养基组成、培养系统和细胞数量，以形成具有睾丸特异性结构和功能的类器官。由30×104个2周龄小鼠的睾丸细胞构成的睾丸细胞球在含有10%KSR的α-MEM中用琼脂糖凝胶培养系统培养14天，能够形成与天然小鼠睾丸组织的管腔结构和细胞分布高度相似的类器官，支持细胞紧密连接构成了血睾屏障。相较于由冻存的睾丸组织、细胞球生成的睾丸类器官，睾丸细胞的冻存是最能维持类器官分化特性及细胞间相互作用的初始冻存样本形式。相关研究成果发表在生命科学领域传统TOP期刊LIFE SCIENCES（Tan J, Li JH, Lin CY, Ye N, Zhang H, Liu CX, et al. Generation of mouse testicular organoids with highly compartmentalized tubular lumen structure and their cryopreservation. Life Sci. 2024;355. 中科院二区top，JCR：Q1）。
图3 小鼠睾丸类器官形成过程的示意图
（4）GelMA水凝胶辅助的睾丸组织冷冻保存策略
冷冻保存睾丸组织对于恢复青春期前癌症男孩和成年不育男性的生育能力至关重要。通过探索将冷冻保护剂与GelMA水凝胶结合的不同预处理方法，并评估了不同CPA成分和冷冻载体，以建立一个完整的包封睾丸组织冷冻保存系统。先包裹睾丸组织再加载30%渗透性保护剂是包封睾丸组织快速冷冻的最佳预处理方法，GelMA水凝胶可调节CPA的扩散速度，减少冷冻损伤，而15% DMSO和15% EG的组合能显著增强线粒体活性。经过在AlgMA 水凝胶上一周的体外培养后，冻后的睾丸组织仍能保持活性和功能性。相关研究成果发表在生殖医学领域传统TOP期刊Reproductive BioMedicine Online（Tan J, Li JH, Lin CY, Zhang YQ, Zhang H, Ye N, et al. GelMA hydrogel as an osmotic barrier to protect mouse testicular tissue from cryo-damage induced by high-concentration cryoprotectants. Reproductive BioMedicine Online. 2024. 中科院二区，JCR：Q1）。
图4 不同预处理方法结合保护剂和GelMA水凝胶的示意图
本研究建立了高效且匹配的睾丸组织和类器官的“低温保存-体外培养”方案，为男性生育力的保存与恢复提供了重要的理论和应用参考。
